在基因組測(cè)序中，PCR擴(kuò)增似乎是繞不過去的一步。然而，PCR也帶來一些問題，包括不均勻擴(kuò)增，導(dǎo)致某些序列的比例過高。對(duì)目前的新一代測(cè)序（NGS）平臺(tái)而言，測(cè)序某些堿基組成上存在嚴(yán)重偏向的基因組區(qū)域仍是一大挑戰(zhàn)。在GEN雜志上，Patricia Fitzpatrick Dimond博士介紹了PCR-Free的基因組測(cè)序。

文庫制備的變革

2009年，Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介紹了一種無需擴(kuò)增的Illumina文庫制備方法（Nature Methods 2009;6:291–295）。他們表示，GC偏向的基因組的定位和組裝有所改善。這種方法采用簇?cái)U(kuò)增步驟來富集*連接的模板鏈，降低了重復(fù)序列的發(fā)生率，改善了序列定位和SNP檢出。

這種方法的核心是采用no-PCR接頭，它們包含額外的序列，讓模板能夠與流動(dòng)槽表面直接雜交，這樣就不再需要PCR步驟。作者表示，通過此方法產(chǎn)生的DNA模板量低于PCR方法，但定量研究表明，從5 μg起始DNA中獲得的文庫足夠400個(gè)GA通道的測(cè)序，這滿足了大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)需求。此外，由于省去了PCR步驟，這種方法比標(biāo)準(zhǔn)的文庫制備更快。

Illumina的產(chǎn)品Rooz Golshani表示：“我們的PCR-free產(chǎn)品，TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit，是金標(biāo)準(zhǔn)，也是產(chǎn)生zui完整基因組的*方案。”Golshani博士指出，研究人員在需要避免PCR相關(guān)的偏向時(shí)，往往采用此試劑盒來制備文庫。

2015年，J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出，隨著全基因組測(cè)序被廣泛用于人類微生物組研究，研究結(jié)果往往被證明是沖突或不確定的（Proc Natl Acad Sci USA 2015;10;112:14024-9）。

研究人員開展定量和定性分析來比較WGS宏基因組數(shù)據(jù)。他們采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系統(tǒng)。研究表明，這四種不同的NGS文庫制備導(dǎo)致分類出現(xiàn)明顯差異。根據(jù)分析的結(jié)果，他們建議從事微生物組研究的研究人員采用PCR-free的方法來減少PCR偏向，從而獲得更準(zhǔn)確的分類信息。

納米孔測(cè)序

這些PCR-free的技術(shù)都是針對(duì)Illumina的測(cè)序儀開發(fā)的，不過，一種顛覆性的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)*改變DNA測(cè)序的方式，這就是納米孔測(cè)序。

Oxford Nanopore Technologies開發(fā)的手機(jī)大小的MinION測(cè)序儀有望zui終拋棄PCR。它讀取長(zhǎng)的DNA片段，不過目前仍需要文庫制備。這種方法在分辨重復(fù)序列或單體型上具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閱蝹€(gè)測(cè)序片段就能跨越含糊不清的區(qū)域。未來，這種設(shè)備有望用于實(shí)時(shí)醫(yī)療診斷和法醫(yī)檢驗(yàn)。

不過，英國(guó)研究人員認(rèn)為，在廣泛采用MinION之前，需要評(píng)估其通量和準(zhǔn)確性（Biomol Detect Quantif 2015;3: 1–8）。他們利用MinION對(duì)三個(gè)細(xì)菌基因組進(jìn)行重測(cè)序，這些有著不同的核苷酸組成。研究人員發(fā)現(xiàn)，MinION堿基檢出后的錯(cuò)誤率為38.2%。讀長(zhǎng)平均值和中值分別為2 kb和1 kb，而zui長(zhǎng)的序列達(dá)到98 kb。作者認(rèn)為，盡管錯(cuò)誤率限制了MinION的競(jìng)爭(zhēng)能力，但是與Illumina MiSeq的數(shù)據(jù)相結(jié)合，MinION的序列數(shù)據(jù)可增強(qiáng)de novo組裝。

隨著MinION的試用報(bào)告不斷出爐，人們發(fā)現(xiàn)，MinION本身也能做很多事情。它能可靠地測(cè)序小型基因組，如細(xì)菌和酵母。它也能區(qū)分親緣關(guān)系很近的細(xì)菌和病毒，讀取人類基因組中的復(fù)雜區(qū)域，并區(qū)分一對(duì)染色體上的兩個(gè)基因版本。此外，傳染病檢測(cè)也有望成為這種手持式測(cè)序儀的一大應(yīng)用。

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