在轉(zhuǎn)基因和敲除研究中，維持多能性對利用小鼠胚胎干(ES)細胞至關重要。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多因子可以影響ES細胞的多能性,其中之一就表現(xiàn)在白血病抑制因子（LIF）對ES細胞培養(yǎng)的影響。關于抑瘤素M（OSM）能補償LIF在ES細胞培養(yǎng)中的作用，對此存在不一致的報道。一些研究提示在維持ES細胞多能性方面，OSM不如LIF有效。然而，其他研究發(fā)現(xiàn)它們是等效的。在本研究中，我們證明在維持ES細胞多能性上，人OSM擁有與小鼠LIF相類似的功效，包括長期（超過10天）維持多能性、體外分化的能力、活化STAT3的能力和種系傳遞能力。我們的研究提示OSM可能是在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的另一種因子，并且在小鼠ES細胞培養(yǎng)時，OSM可以被用作LIF的替代物。

抑瘤素M維持未分化ES細胞的形態(tài)

圖1：LIF或OSM中長期培養(yǎng)后的細胞形態(tài)比較。（圖A，C），細胞培養(yǎng)于103 U/mL的LIF中。（圖B，D），細胞培養(yǎng)于10 ng/mL的OSM中。圖A和圖B是生長于輻射照過MEF細胞上的細胞，圖C和圖D是生長于明膠包被平板上的細胞。

圖像攝于第6代，然而，細胞在OSM培養(yǎng)基中可以連續(xù)25代維持未分化形態(tài)。箭頭所指是具有未分化形態(tài)的ES細胞克隆。所有圖片在200倍鏡下拍攝。

材料和方法

細胞培養(yǎng)：CJ7 ES細胞系由Tom Gridley贈予。高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基另加15%胎牛血清（FBS），4 mM谷氨酰胺，10 μM ，1% MEM非必需氨基酸，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，和每毫升103 U的LIF （ESGRO；Chemicon，Temecula CA）或者10 ng/mL的抑瘤素M（R&D Systems，目錄#295-OM），以此培養(yǎng)ES細胞。細胞生長于輻射照過的小鼠胚胎滋養(yǎng)細胞（MEFs）上或者0.1%明膠包被的平板上。細胞每兩天傳代一次。

把106個細胞傳到含有10%FBS，每毫升50 IU青霉素，每毫升50 μg鏈霉素，4 mM谷氨酰胺和DMEM培養(yǎng)基的6孔組織培養(yǎng)皿中，以此制備類胚體（EBs）。用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿，分離細胞團。把細胞團轉(zhuǎn)移至有蓋培
養(yǎng)皿，然后每天更換培養(yǎng)基。要進行分化時，懸浮培養(yǎng)EBs 4至6天，然后轉(zhuǎn)移0.1%明膠包被的24孔板，讓細胞貼板生長7天，再進行免疫細胞化學實驗或為RT-PCR提取RNA。

RT-PCR：用RNAeasy試劑盒（Qiagen），根據(jù)產(chǎn)品說明書從未分化的ES細胞和分化的EBs中提取RNA。使用Superscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen），根據(jù)產(chǎn)品說明書，500 ng RNA通過隨機六聚體引物進行逆轉(zhuǎn)錄。2 μL cDNA用作擴增模板。所有引物在55℃下退火，擴增35個循環(huán)。

免疫細胞化學：所用一抗（rtxh/mOct3/4；mxh/mSox2；gtxmNanog；mxβIIITubulin；mxhTroponinT和gtxhHNF3β）購于R&D Systems。細胞或EBs轉(zhuǎn)養(yǎng)到24孔板中的蓋玻片上。在室溫下用4%多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后將細胞在含有1%BSA（PBA）的PBS中洗4次。用含有PBA溶解的0.1%Triton X-100的10%驢血清封閉細胞45分鐘。然后加入10 μg/mL的一抗，孵育3個小時，之后把細胞在PBA中清洗三次，每次洗5分鐘。然后，用5 μg/mL的NothernLightsTM557連接的二抗（R&D Systems）孵育細胞1個小時，然后如上清洗細胞。

STAT3活化水平：用Active STAT3 DuoSet IC試劑盒（R&D Systems）檢測STAT3的活化水平。根據(jù)試劑盒說明書，用生長于或未生長于MEFs上的未分化ES細胞制備細胞核提取物。用Bradford檢測對蛋白質(zhì)進行定量分析。STAT3活化水平根據(jù)產(chǎn)品說明書而確定，然后根據(jù)總蛋白水平進行標準化處理。

小鼠嵌合體的生物試劑：所有程序由密西根大學動物使用和照顧委員會批準。根據(jù)國家研究委員會關于實驗動物照顧和使用指南概述的原則和程序?qū)游锾峁┱疹櫋Ｔ诤蠰IF或者OSM的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次后，用胰蛋白酶處理細胞，然后將16個ES細胞顯微注射到囊胚中。囊胚取自與C57BL/6J X DBA/2J/F1雄小鼠（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）交配的超數(shù)排卵的C57BL/6NCrl雌小鼠（Charles River Laboratories，Wilmington，MA）。注射當天，用標準方法把顯微注射的囊胚轉(zhuǎn)移到假孕的受體雌鼠體內(nèi)。用嵌合體與C57BI/6J雌鼠交配來檢測種系傳遞。

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