WB蛋白印跡蛋白質電泳分離的操作步驟：
1．樣本處理
蛋白質樣本首先經過離心（4 ℃，15000 r/min 離心 30 分鐘）除去不溶物，再經 SDS 上樣緩沖液 100 ℃ 變性 3～5 分鐘，使帶有強負電荷的 SDS 與帶有較弱電荷的蛋白質結合，大量 SDS 可掩蓋蛋白質自身的電荷量，只顯示 SDS 的負電荷，在 pH8.6～pH8.8 的 Tris-甘氨酸不連續 SDS-PAGE 系統中，蛋白質的泳動與自身電荷量無關，只和其分子大小有關，從而將蛋白質按分子量大小順序分離。
電泳樣品中總蛋白質濃度不能超過凝膠系統的裝載能力，可采用微型電泳系統時，每一個加樣孔內的總蛋白量不能大于 5 μg，目的蛋白量在 10 ng 左右較好，蛋白量過高將出現拖尾或蛋白帶融合現象。蛋白質樣本如經過濃縮，須用合適緩沖液透析除鹽后上樣，否則在高鹽狀態下電泳將出現電泳帶扭曲的現象。
2．凝膠選擇
根據目的蛋白質分子大小選擇合適的凝膠濃度，一般情況下，用于免疫印跡的 SDS-PAGE 凝膠濃度與所分離的蛋白質分子量間的關系如表 1 所示。為提高樣本分辨率，通常采用高一級凝膠濃度的電泳系統，將獲得更好的結果。
表 1 凝膠濃度與蛋白分子量的關系
凝膠濃度 | 分離蛋白質范圍（MW） |
8% | >50000 |
10% | 30000～200000 |
12% | 20000～150000 |
14% | 10000～100000 |
17% | 5000～100000 |
為使電泳后蛋白質從電泳凝膠中轉移至固相支持膜上，還須考慮凝膠的濃度及厚度。凝膠的百分含量和交聯度越低，轉移越容易，最軟的凝膠可產生好的轉移效率，但凝膠濃度過低可導致電泳帶變寬、融合，降低分辨率。凝膠越薄，轉移效率也就越高，但過薄的凝膠易碎，導致操作困難。多數情況下采用 0.5～1 mm 厚凝膠，為提高蛋白上樣量和檢測敏感度，可適當增加凝膠厚度，但不宜超過 2 mm。
3．蛋白質標準品選擇蛋白質凝膠電泳需要蛋白質標準品（molecular weight marker）指示系統，來顯示電泳的分離效率、轉膜效率以及樣本泳動情況。SDS-PAGE 凝膠電泳如采用普通蛋白質標準品，須經蛋白質染色后才能確認上述電泳參數，故問題發現不及時，常常導致無效的重復電泳。彩色標準品（rainbow marker）可彌補這一欠缺，如表 2 所示，該 Marker 在電泳凝膠中隨蛋白質的遷移，各分子量條帶逐漸分開，并顯示多種色彩的條帶，可直接肉眼觀察泳動及分離情況，當目的分子量大小的 Marker 遷移到合適位置（距凝膠底部 1/3 處），同時其與相鄰兩條 Marker 達到足夠分辨距離時，即可停止電泳，取出凝膠。蛋白質樣本轉膜后的轉膜效率和目的蛋白質分子量，均可通過彩色標準品直接推算。
表 2 常用高分子量彩色標準品
標準蛋白質 | 分子量 | 顏色 |
myosin | 200000 | 青 |
phosphorylase b | 97400 | 茶 |
BSA | 00069 | 紅 |
ovalbumin | 46000 | 黃 |
carbonic anhydrane | 30000 | 橙 |
trypsin inhibitor | 21500 | 綠 |
lysozyme | 14300 | 赤紫 |
4．SDS-PAGE
1）安裝電泳裝置和玻璃板。
2）配制分離膠：按照所需濃度和體積依次混合 H2O，30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10% SDS，10% 過硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。
3）迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液，留出沉積膠所需體積和梳子齒長高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H2O，垂直放置于室溫中，約 30 分鐘使膠凝聚。
4）倒出分離膠上方覆蓋液體，盡量吸干。
5）配制 5% 濃縮膠，依次混合 H20，30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10% SDS，10% 過硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。
6）在分離膠上方灌入濃縮膠，并插入梳子，避免氣泡！再灌入適量濃縮膠填滿梳子齒間縫隙，垂直放置于室溫。
7）將蛋白樣品加入等量 2X SDS 加樣緩沖液，100 ℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000 r/min，常溫離心 3 分鐘。
8）取出濃縮膠中梳子，以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中，在上、下槽均加滿 Tris-Glysine 電泳緩沖液。
9）加樣 10～20 μl。
10）將電泳裝置通電，電壓 8V/cm，當染料前沿進入分離膠后，電壓提高到 15V/cm，電泳至溴酚藍到達膠底部，約 2～4 小時。
11）關閉電源，取出玻璃板，撬開玻璃板，小心取出凝膠。
WB蛋白印跡蛋白質電泳分離的操作步驟
更新時間：2023-04-06 
瀏覽次數：476
您的位置：
