OMG！免疫組化染色呈陰性結果的原因原來是這樣的！

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1、抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。不知抗體是進口的還是國產的工作液，怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結果?另外，不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果，抗原抗體反應有前帶和后帶效應，必須摸索*濃度。

2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合;建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是*的時間和次數。若不行，還可高壓修復。

3、組織切片本身這種抗原含量低;

4、血清封閉時間過長。

5、DAB孵育時間過短。

6、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

實際解決方案：

1、首先，排除組織切片內的抗原有無丟失及其含量多少。免疫組化中兩個zui重要的因素是抗原和抗體。(1)抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過3-6個月，可能切片內的抗原丟失很嚴重(有文獻支持)，此時可以通過重新用石蠟塊切片來進一步驗證(蠟塊需要低溫保存)。(2)石蠟切片在制作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉，這需要通過抗原修復來充分暴露，從而增加抗原抗體結合反應，提高陽性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復，用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓的，我做胎鼠睪丸間質細胞鑒定，用1：200一抗效果很好;但我用1：200一抗孵育成年睪丸間質細胞檢測，幾乎呈陰性，后來證實是因為兩者抗原含量相差甚遠，則一抗也要適當提高濃度。

2、其次，檢查抗體有無選擇錯誤和抗體孵育條件是否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現陰性結果，因為靈敏度低但特異性好;一抗的species reactivity中無檢測組織的種屬，這是比較常見的錯誤;一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現陰性結果。(2)抗體孵育時間過短，容易導致陰性結果。一般一抗我建議4度孵育過一夜和37度復溫45min;二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。(3)抗體濃度過低。這是陰性結果的zui可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了，直接滴加)，重點摸索一抗的zui適濃度。注意：免疫反應中存在前帶和后帶效應，這提示不是濃度越高，陽性率就越高，反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質量：原裝抗體一般比較穩定，效果較好;而進口分裝次之;工作液可能要注意質量問題。

3、同時，DAB的孵育時間可能要適當延長，在鏡下觀察，有時可延長至30min。但一般3-10min，此時背景也較淺。否則，說明抗體濃度不合適。

4、zui后，血清封閉時間也可相應縮短。一般10-30min，但這個時間可以調整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外，細胞通透也不可忽視。許多戰友認為石蠟切片一般不需細胞通透，因為切片時可能已經把細胞切開了，但對于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進抗體等試劑充分進入參與反應。

6、以上原因，都是針對實際中常見原因來進行分析的，前提是排除操作者的操作錯誤而引起陰性結果，這就需要新手還是要設置陽性對照以排除方法的問題。還有抗體稀釋液的PH值過低等其它原因的干擾。

總之，要想把免疫組化做好，可能每一個環節都很重要，但也存在主次之分，出現問題了，需要通過先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對免疫組化原理掌握與否的關鍵所在。

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